無縫克隆試劑盒-單片段

貨號(hào)：D0205P

存儲(chǔ)溫度 ：-20°C 

產(chǎn)品組分

無縫克隆試劑盒-單片段

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依 據(jù)  DNA  片段與線性化載體末端的  15~25 nt  同源序列的重組 ，可將插入片段克隆至任意載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景 極低 ，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的 DNA 定向克隆技術(shù)。

DNA Assembly Mix Single Plus 無縫克隆試劑盒，專為單片段優(yōu)化，最快僅需5 分鐘即可完成單片段  重組 ，且陽(yáng)性率高于95%。DNA Assembly Mix Single Plus  相較于  DNA Assembly Mix  Plus 

(Cat:D0204P) ，不依賴連接酶，組分更簡(jiǎn)單，對(duì)未純化的  PCR 產(chǎn)物兼容性更強(qiáng)。同時(shí)，由于不含連接酶，依靠大腸桿菌本身的修復(fù)系統(tǒng)，保真度更高。

產(chǎn)品應(yīng)用

快速克??；單片段  DNA 組裝；DNA 定點(diǎn)突變。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)流程概要

注 1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；

注 2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反 應(yīng)。

注 3 ：載體膠回收時(shí)建議長(zhǎng)時(shí)間電泳與殘留的環(huán)狀質(zhì)粒區(qū)分開后再切膠， 以減少假陽(yáng)性率。

2. 線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點(diǎn)，對(duì)載體進(jìn)行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR擴(kuò)增完成。

① 酶切制備

推薦使用 LabFD™快速內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切 ，使載體線性化wan全，以降低轉(zhuǎn)化背景(假陽(yáng)性克隆)；若使用單酶切進(jìn)行線性化，可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

② 反向  PCR 擴(kuò)增制備

為減少擴(kuò)增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò) 增。推薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板 ，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘 留對(duì)克隆陽(yáng)性率的影響。

注  1 ： PCR 產(chǎn)物無非特異性條帶時(shí) ，推薦使用 LabFD™  DpnI (  貨號(hào) ： F5585S) 1  μl 加入  50  μl PCR 產(chǎn)物中  37℃  1 h ，80℃  20 min  消化 質(zhì)粒模板即可用于重組反應(yīng)；反之建議將  PCR 產(chǎn)物膠回收后使用。

3.  插入片段 PCR 引物設(shè)計(jì)

PCR 引物的 5'  端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載 體）末端同源的 15~25 nt（推薦 18nt）序列。假如載體為粘 性末端 ，且 3'端突出 ，則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分；若 5'端 突出 ，則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分 ，也可以不包含。

插入片段正向擴(kuò)增引物：

5'—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)（可選） + 基因特

異性正向擴(kuò)增序列—3'    插入片段反向擴(kuò)增引物：

3'—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)（可選）+下游載 體末端同源序列—5'

注 1：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆 ，當(dāng)載體克隆位 點(diǎn)上下游 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為 40% ~60%時(shí) ，重組效lv最高；

注 2 ：包含多個(gè)重復(fù)序列的片段無法采用無縫克隆的策略進(jìn)行連接。

注  3 ：包含多個(gè)重復(fù)序列的片段無法采用無縫克隆的策略進(jìn)行連接。

4.  插入片段的  PCR 擴(kuò)增

推薦使用高保真 PCR Mix（ Cat：T1211）進(jìn)行擴(kuò)增 ，以減少擴(kuò)增突變的引入。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫克   隆反應(yīng)，若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物， 可直接使用 ，但加樣體積不應(yīng)超過總反應(yīng)體積的 20%。

5.  重組反應(yīng)

① 于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

a.最適載體用量(ng) =0.02×載體堿基對(duì)數(shù) ，即 0.03 pmol。

b.插入單片段 ，最適片段用量（ ng） = 0.04×片段堿基對(duì)數(shù)。

c.陰性對(duì)照可用來確認(rèn)線性化載體中是否有環(huán)狀質(zhì)粒殘留 ，推 薦進(jìn)行。

注  1 ：若插入單片段長(zhǎng)度大于載體 ，則應(yīng)互換載體與插入片段用量；

注  2 ：若插入片段長(zhǎng)度小于 200 bp ，則插入片段應(yīng)使用 5 倍載體用量；

注  3：若按上述公式計(jì)算得到的用量超過最di/最高值，則建議直接按最di/ 最高用量使用；

注  4 ：載體片段過長(zhǎng)、插入片段過長(zhǎng)或片段數(shù)過多 ，克隆菌落數(shù)和陽(yáng)性率 均會(huì)降低。

注 5 ：?jiǎn)吸c(diǎn)突變按照最適載體用量加入體系。

重組反應(yīng)體系配制完成后 ，用移液槍輕輕吸打混勻各組 分 ，避免產(chǎn)生氣泡 ，切勿渦旋。

② 將反應(yīng)體系置于 50℃ ,  反應(yīng) 5~15min。

注  1 ：推薦使用  PCR 儀等溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng) ，反應(yīng)時(shí)間不足 克隆效率均會(huì)降低；

注  2 ： 50℃反應(yīng)完成后 ，建議進(jìn)行瞬時(shí)離心 ，將反應(yīng)液收集至管底。

③ 將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻 ，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或者儲(chǔ)存于-20℃。

注  1 ：-20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物 ，建議在 1 周內(nèi)使用。

6.  重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取 10μ l 反應(yīng)液，加入到 100μ l 感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置 30 min。42℃熱激 60 s，冰浴 5 min。加 500μl SOC 或 LB 培養(yǎng)基 ，37℃振蕩培養(yǎng) 50~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對(duì)應(yīng)抗生素的平板上，倒置于 37℃過夜培養(yǎng)。

注 1 ：不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽(yáng)性率會(huì)有所差別 ，推薦使用轉(zhuǎn)化效 率 >108 CFU/μg 的感受態(tài)細(xì)胞；

注 2 ：菌落數(shù)取決于 PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

7.   陽(yáng)性克隆檢測(cè)

挑取單菌落至 10μ l ddH2O 中混勻 ，95℃裂解 10 min   后，取 1μ l 裂解液作為模板，進(jìn)行菌落 PCR 鑒定(Cat：T0214)， 或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進(jìn)行   酶切鑒定。

注  1 ：菌落  PCR 時(shí)建議至少使用一條通用引物 ，避免假陽(yáng)性結(jié)果；

注 2 ：必要時(shí)可進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行測(cè)序鑒定。